Estructura de proteínas y función.

Estructura de los aminoácidos.

General

Las proteínas son las moléculas más abundantes y funcionalmente diversas de los sistemas vivientes. Prácticamente cada proceso viviente depende de esta clase de moléculas. Por ejemplo, las enzimas y las hormonas polipeptídicas dirigen y regulan el metabolismo del cuerpo, mientras que las proteínas contráctiles del músculo permiten el movimiento. En el hueso, la proteína colágeno forma un entramado para la deposición de cristales de fosfato de calcio, actuando como los cables de acero en el concreto reforzado. En la sangre, proteínas tales como hemoglobina y albúmina sérica transportan moléculas esenciales para la vida, mientras que las inmunoglobulinas destruyen bacterias infecciosas y virus. En síntesis, las proteínas muestran una variedad increíble de funciones y, sin embargo, todas comparten la característica estructural común de ser polímeros lineales de aminoácidos. A continuación describiremos las propiedades de los aminoácidos. Luego, exploraremos cómo estas unidades simples se unen para formar proteínas que poseen conformaciones tridimensionales únicas, haciéndolas capaces de realizar funciones biológicas específicas.

Estructura de los aminoácidos

Aunque se han descripto en la naturaleza más de 100 aminoácidos diferentes, solamente 20 de estas especies se encuentran, comúnmente, formando parte de las proteínas de mamíferos. Cada aminoácido (excepto la prolina) posee un grupo carboxilo, un grupo amino y una cadena lateral que lo distingue (grupo "R"), unida al carbono a. A pH fisiológico (aproximadamente 7,4) el grupo carboxilo se encuentra disociado para formar el ión carboxilato con carga negativa (-COO-) y el grupo amino se encuentra protonado (-NH3+).

En las proteínas, estos grupos carboxilo y amino se combinan en uniones peptídicas y no se encuentran disponibles para reacciones químicas (a excepción de los puentes de hidrógeno, como veremos más adelante). De esta manera, es la naturaleza de las cadenas laterales la que dictará el papel que un aminoácido jugará en la proteína. Es, por lo tanto, útil clasificar a los aminoácidos de acuerdo con la polaridad de sus cadenas laterales, es decir, si son no polares, polares no cargadas, ácidas o básicas.

A) Aminoácidos con cadenas laterales no polares:

Glicina (Gly), Valina (Val), Alanina (Ala), Leucina (Leu), Isoleucina (Ile), Triptofano (Trp), Fenilalanina (Phe), Metionina (Met) y Prolina (Pro).

1- Cada uno de estos aminoácidos posee una cadena lateral no polar que no une o entrega protones ni participa en uniones puentes de hidrógeno o iónicas.

2- En las proteínas, las cadenas laterales de estos aminoácidos pueden agruparse debido a su hidrofobicidad, tal como ocurre con las gotas de aceite que cohalescen en soluciones acuosas. La importancia de estas interacciones hidrofóbicas en la estabilización de la estructura proteica, se discutirá más adelante.

3- La prolina difiere de otros aminoácidos en que contiene un grupo imino en lugar de un grupo a-amino.

B) Aminoácidos con cadenas laterales polares pero no cargadas:

Asparagina o asparragina (Asn), Glutamina (Gln), Cisteína (Cys), Serina (Ser), Treonina (Thr), Tirosina (Tyr).

1- Estos aminoácidos tienen carga neta cero a pH neutro, aunque las cadenas laterales de la cisteína y la tirosina pueden perder un protón, a pH alcalino.

2- La cadena lateral de la cisteína posee un grupo sulfhidrilo (-SH), el que es un componente importante del sitio activo de muchas enzimas. En las proteínas, los grupos -SH de dos cisteínas pueden condensarse para formar el aminoácido cistina, el que contiene una unión covalente denominada puente disulfuro (-S-S-).

3- La serina, treonina y tirosina, contienen un grupo hidroxilo polar que, en las proteínas, puede participar en la formación de puentes de hidrógeno o servir como sitio de unión de grupos fosfatos o carbohidratos. Las cadenas laterales de la asparagina (o asparragina) y glutamina, contienen un grupo carbonilo y un grupo amida que pueden participar de uniones puente de hidrógeno o servir como sitios de unión de carbohidratos.

C) Aminoácidos con cadenas laterales ácidas:

Acido aspártico (Asp) y ácido glutámico (Glu).

1- Los aminoácidos aspártico y glutámico son dadores de protones. A pH neutro, las cadenas laterales de estos aminoácidos están completamente ionizadas y contiene un grupo carboxilato cargado negativamente (-COO-). Se los llama, por lo tanto, aspartato y glutamato para enfatizar que, a pH fisiológico, estos aminoácidos se encuentran con carga negativa.

D) Aminoácidos con cadenas laterales básicas:

Lisina (Lys), Arginina (Arg), Histidina (His).

1- Las cadenas laterales de estos aminoácidos básicos unen protones. A pH fisiológico las cadenas laterales de la lisina y arginina están completamente ionizadas y con carga positiva.

2- Por el contrario, la histidina es débilmente básica y el aminoácido libre permanece, en gran medida, sin carga a pH fisiológico. En las proteínas, sin embargo, la cadena lateral de la histidina puede estar con carga positiva o neutra, dependiendo del medio ambiente provisto por las cadenas polipeptídicas de la proteína.

Preguntas para estudiar:

Responda:

A si 1, 2 y 3 son correctas

B si 1 y 3 son correctas

C si 2 y 4 son correctas

D si solamente 4 es correcta

E si todas son correctas

1.1 ¿Cuáles de las siguientes afirmaciones describen a la cadena lateral del aminoácido serina?

1. Contiene un grupo hidroxilo

2. Puede formar uniones disulfuro

3. Puede participar de uniones puente de hidrógeno

4. Está cargada a pH fisiológico.

1.2 ¿Cuáles de los siguientes aminoácidos poseen una cadena lateral cargada a pH fisiológico?

1. Acido aspártico

2. Lisina

3. Acido glutámico

4. Asparagina (o asparragina)

1.3 La glutamina:

1. Contiene tres grupos titulables

2. Contiene un grupo amida

3. Es clasificada como un aminoácido ácido

4. Contiene una cadena lateral que puede formar puentes de hidrógeno en proteínas.

1.4 ¿Cuáles de las siguientes afirmaciones acerca de los aminoácidos son verdaderas?

1. La glicina contiene dos hidrógenos disociables

2. La tirosina es un sitio de unión de grupos fosfato en proteínas

3. La cisteína es un aminoácido que contiene azufre

4. La glutamina es clasificada como un aminoácido básico.

Para evaluar las respuestas, luego de contestar las preguntas, hacer un click aquí (...no hacer trampa...)

Aminoácidos como buffers

Los aminoácidos contienen grupos a-carboxilo débilmente ácidos y grupos a-amino, débilmente básicos. Además, cada uno de los aminoácidos ácidos y básicos, contiene un grupo ionizable en su cadena lateral. De esta manera, tanto los aminoácidos libres como los combinados en uniones peptídicas pueden actuar, potencialmente, como buffers. La relación cuantitativa entre [H+] y los ácidos débiles puede describirse según la ecuación de Henderson-Hasselbalch.

Nota: No sean vagos y busquen en un libro de Química o Química Biológica la ecuación de Henderson-Hasselbalch para refrescar sus memorias....

El punto isoeléctrico (pI) es el pH para el que una molécula es eléctricamente neutra, es decir, donde la suma de las cargas positivas iguala a la suma de las cargas negativas. La forma en que se encuentra la molécula en el punto isoeléctrico se denomina zwitterion o forma isoeléctrica.

Para calcular el pI de un aminoácido o de un polipéptido, se comienza escribiendo la estructura molecular más protonada, se anotan los pKa de los distintos grupos ionizables y se va desprotonando la molécula de acuerdo con los pKa crecientes. Una vez ubicado el zwitterion (carga neta cero), se calcula el pI como el promedio entre el pKa anterior y el pKa posterior a la estructura isoeléctrica.

Preguntas para estudiar:

Elegir la mejor respuesta (una sola):

1.5 Lisina (pK1= 2,2 - pK2= 9,0 - pK3= 10,5)

A. Contiene un grupo amida

B. Posee una carga +1 cuando el grupo carboxilo se encuentra protonado

C. Posee un pI de 5,6

D. Migrará hacia el cátodo (electrodo negativo) durante una electroforesis a pH 7

E. Posee una cadena lateral no polar.

1.6 La histidina presenta una cadena lateral con un pK= 6,0. ¿Cuál de los aminoácidos siguientes también tiene una cadena lateral que se titula dentro de 1,5 unidades de pH respecto de la neutralidad?

A. Lisina

B. Arginina

C. Treonina

D. Cisteína

E. Hidroxiprolina

Hacer click aquí para ver las respuestas...(sin trampa)...

Propiedades ópticas de los aminoácidos

A. El carbón a de cada aminoácido se encuentra unido a cuatro grupos químicos diferentes y es, por lo tanto, un átomo de carbono quiral u ópticamente activo. La glicina es la excepción dado que este carbono posee dos sustituyentes hidrógeno y, por lo tanto, es ópticamente inactivo.

B. Todos los aminoácidos encontrados en las proteínas pertenecen a la configuración L. Sin embargo, los aminoácidos de la serie D pueden encontrarse en algunos antibióticos y paredes celulares bacterianas.

Unión peptídica

A. En las proteínas, los aminoácidos se encuentran unidos covalentemente por enlaces peptídicos que son enlaces amida entre el grupo a-carboxilo de un aminoácido y el a-amino de otro. Por ejemplo, la glicina y la alanina pueden formar el dipéptido glicilalanina a través de la formación de un enlace peptídico. Por convención, el término amino libre (N-terminal) se escribe a la izquierda y el carboxilo libre (C-terminal) hacia la derecha. Por lo tanto, todas las secuencias de aminoácidos se leen desde el extremo N hacia el C-terminal del péptido.

B. La unión de muchos aminoácidos a través de enlaces peptídicos, resulta en una cadena no ramificada llamada polipéptido. Cada aminoácido componente en un polipéptido se llama residuo. Cuando los compuestos se nombran, todos los residuos aminoacídicos cambian la terminación de sus nombres de -ina a -il, excepto el C-terminal. Por ejemplo, un tripéptido compuesto de valina N-terminal, una glicina central y una leucina C-terminal, se llamará valil-glicil-leucina.

C. La unión peptídica posee un carácter de doble ligadura parcial y es, por lo tanto, rígida y planar. Esto impide la rotación libre alrededor de la unión entre el grupo carbonilo y el nitrógeno de la unión peptídica.

D. Como todas las uniones amida, la unión peptídica no acepta ni entrega protones en el rango de pH de 2 a 12. Por lo tanto, los grupos cargados presentes en los polipéptidos consisten, exclusivamente, de los grupos N-terminal, C-terminal y cualquier grupo ionizable presente en la cadena lateral de los aminoácidos constituyentes.

E. Las uniones peptídicas no se rompen por manejo normal o condiciones que desnaturalizan proteínas (tales como calentamiento solamente o altas concentraciones de urea). Se requieren ácidos o bases fuertes a temperaturas elevadas para hidrolizar estas uniones.

Preguntas para estudiar:

Conteste:

A si son correctas las respuestas 1, 2 y 3

B si 1 y 3 son correctas

C si 2 y 4 son correctas

D si solamente 4 es correcta

E si todas son correctas

1.7 La unión peptídica

1. Es un tipo especial de unión amida

2. Posee un carácter parcial de doble ligadura

3. No está ionizada a pH fisiológico

4. Se rompe por agentes que desnaturalizan proteínas, tales como solventes orgánicos o altas concentraciones de urea.

1.8 El péptido alanil-glicil-serina

1. Contiene alanina con un grupo a-amino libre

2. Contiene tres enlaces peptídicos

3. Es ópticamente activo

4. Es un dipéptido.

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Estructura de proteínas

General

Arriba hemos descripto la estructura de los 20 aminoácidos encontrados en las proteínas y la manera principal en que estas unidades se unen mediante los enlaces peptídicos. Examinaremos, a continuación, cómo una secuencia lineal de aminoácidos genera una molécula proteica con una forma tridimensional única. La complejidad de la estructura proteica se analiza mucho mejor si se considera a la molécula en términos de cuatro jerarquías organizativas, es decir, estructuras primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria.

Estructura primaria de las proteínas

La secuencia de aminoácidos en una proteína se conoce como estructura primaria. La determinación del orden de aminoácidos en una cadena polipeptídica requiere la utilización de diversas técnicas experimentales. Primero, se analiza la composición en aminoácidos, es decir, el tipo y la cantidad de aminoácidos presentes en la proteína y se tabula. Luego, se determina la identidad de los aminoácidos en los extremos de la proteína. Finalmente, el polipéptido original se corta específicamente en fragmentos más pequeños, cuyas secuencias pueden ser determinadas. Estos fragmentos pueden, luego, ser ordenados para reconstruir la secuencia del polipéptido original. Veamos estas técnicas:

A. Composición aminoácidica de los polipéptidos:

1. Hidrólisis ácida: El primer paso para determinar la estructura primaria de una proteína es identificar y cuantificar sus constituyentes. La proteína o polipéptido a ser analizados se hidrolizan, primero, por tratamiento con ácido fuerte a 110° durante 24 horas. Este tratamiento rompe las uniones peptídicas y libera los aminoácidos individuales. Además, la glutamina y asparragina (o asparagina) se hidrolizan a glutamato y aspartato, respectivamente, mientras que el triptofano se destruye casi por completo.

2. Cromatografía: Los aminoácidos individuales, obtenidos por hidrólisis ácida de la proteína, se separan por cromatografía de intercambio iónico. En este método, se siembra una mezcla de aminoácidos sobre una columna que contiene un intercambiador iónico insoluble. En las condiciones acídicas empleadas, todos los aminoácidos poseen una carga positiva y quedan unidos a la columna de intercambio que posee una carga negativa. Cada aminoácido es liberado, secuencialmente, de la columna cromatográfica mediante elución con soluciones de fuerza iónica y pH crecientes. A medida que el pH aumenta, los aminoácidos pierden protones, primero de los carboxilos y, luego, de las cadenas laterales y grupos amino. Al ir perdiendo los protones, los aminoácidos se vuelven más negativos y se liberan de la resina. Cada aminoácido eluirá de la columna a un pH y fuerza iónica específicos.

3. Análisis cuantitativo: Los aminoácidos separados, encontrados en el eluido de la columna, se analizan cuantitativamente por calentamiento con ninhidrina, un reactivo que forma un compuesto de color azul con la mayoría de los aminoácidos, amoníaco y aminas (pero forma un derivado amarillo con el nitrógeno imino de la prolina). La cantidad de cada aminoácido se determina espectrofotométricamente, determinando la cantidad de luz absorbida por el derivado de ninhidrina. Se registra en forma continua la absorbancia de cada derivado de aminoácido en un registrador. Cada pico en el registrador corresponde a un aminoácido individual; el área debajo de cada pico es proporcional a la cantidad de ese aminoácido en particular, presente en el polipéptido original. La composición en aminoácidos se informa como residuos de cada uno por molécula proteica. El análisis, así descripto, se realiza, generalmente, mediante un analizador automático.

B. Determinación del aminoácido N-terminal.

1. Método de Sanger: Están disponibles diversos métodos para identificar al aminoácido localizado en el extremo amino terminal de la cadena polipeptídica. En el método de Sanger, el fluorodinitrobenceno reacciona con los grupos a-amino de los aminoácidos N-terminales, para formar un dinitrofenil-derivado (DNP) del aminoácido. La unión entre el grupo DNP y el aminoácido no se rompe por hidrólisis ácida suave. De este modo, el aminoácido que se ha transformado en el derivado DNP, puede ser aislado luego de la hidrólisis del polipéptido. El derivado DNP del aminoácido, que corresponde al extremo amino terminal, puede ser identificado por cromatografía de intercambio iónico.

2. Reactivo de Edman: También puede utilizarse el fenilisotiocianato, conocido como reactivo de Edman, para marcar el aminoácido N-terminal. El derivado de feniltiohidantoína (PTH) formado, puede ser clivado en forma específica del polipéptido, sin perturbar al resto de los enlaces peptídicos entre los restantes residuos aminoacídicos. El reactivo de Edman posee una ventaja frente al reactivo de Sanger: puede ser aplicado sucesivamente sobre el polipéptido acortado en el paso anterior. Usando técnicas automatizadas, la repetición de este método puede utilizarse para determinar la secuencia de más de 100 aminoácidos, comenzando desde el extremo N-terminal.

C. Determinación del aminoácido C-terminal.

1. Hidrazina: Todos los grupos carbonilo, unidos en enlace peptídico, reaccionan con hidrazina para formar hidrazonas. Sin embargo, el aminoácido C-terminal no reacciona con la hidrazina y, por lo tanto, es liberado sin modificación y puede ser separado de los residuos modificados e identificado.

2. Carboxipeptidasa: Esta exopeptidasa cliva, secuencialmente, los enlaces peptídicos comenzando desde el extremo C-terminal. El aminoácido C-terminal será, por lo tanto, el primer aminoácido liberado por la carboxipeptidasa.

D. Ruptura de los polipéptidos en fragmentos pequeños.

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